全人源抗体优化ELISA实验结果重点关注的四个方面

359660243 · 发表于 2023-11-21 20:08:15

　　全人源抗体ELISA即酶联吸附试验，ELISA基于特异性抗原抗体反应，是一种常用的固相酶免疫测定方法。ELISA方法被广泛应用于各种抗原和抗体测定。但ELISA测定中影响因素较多，而且其操作中有一定的技术要求，在中除正常反应外，有时常可见到一些错误结果（即假阳性或假阴性结果）。通常优化ELISA实验结果重点关注的四个方面如下：
　　1、选择最适合您需求的ELISA方法
　　ELISA可以通过多种方式进行配置，所有这些方式都涉及在封闭前将抗原固定到微孔板表面，用抗体进行探测，并测量产生的信号。尽管可以直接固定抗原（一种常用于监测体液中抗体的方法），但夹心ELISA通常是首选，尤其是对于复杂样品，因为它提供了更高的特异性。
　　ELISA方法在很大程度上取决于实验的目的和可用的试剂。在许多情况下，研究人员更喜欢使用现成的ELISA试剂盒，因为这些试剂盒经过全面优化，可节省时间、金钱和样品材料。
　　2、采取措施解决背景问题
　　稳健的洗涤技术是最大限度减少ELISA中背景信号的最有效方法之一。优化洗涤步骤的数量、持续时间和体积，以及洗涤缓冲液的去污剂浓度，对于确保去除任何可能影响结果的未结合试剂至关重要。为了获得更一致的ELISA数据。
　　3、注意标准曲线
　　标准曲线对于获得定量ELISA结果至关重要，因为它用于计算未知样品的浓度。出于这个原因，用于生产它的参考材料必须是高质量的，并且有足够的数量，以在分析的整个生命周期内实现可重复的性能。
　　ELISA数据通常以相对于测定读数的分析物浓度表示，可以是比色，荧光或化学发光。在标准曲线范围内使用更多点（理想情况下为8个或更多）提供了消除异常值的灵活性，并在信号响应范围内更好地定义曲线以改进拟合。对于曲线分析，线性拟合通常适用于夹心ELISA，但4参数逻辑(4PL)模型可以更好地拟合所测量浓度范围的极低端或高端。拟合的正确性可以通过反拟合来验证。
　　4、确保可重复性和准确性
　　可重复性和准确性对于任何免疫测定都是必不可少的，但当定量ELISA 数据用于推动关键决策（例如是否对潜在候选药物进行进一步测试）时，要求可能特别严格。保护措施包括增加重复次数（例如三次重复而不是重复测试），并不仅在每次实验运行中，而且在同一运行中的每个板上合并标准曲线。为了额外保证检测间的重现性，添加另一个内部对照来补充标准曲线可提供更大的结果可信度。作为一般规则，重复读数的变异系数 (CV) 不应超过 20%。
　　实验注意事项：
　　1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
　　2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
　　3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
　　4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。
　　5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
　　6．底物请避光保存。
　　7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.
　　8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
　　9．本试剂不同批号组分不得混用。

全人源抗体优化ELISA实验结果重点关注的四个方面

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