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ningxueqin 发表于 2023-3-14 16:46:28
羊驼抗体生产公司ELISA实验之酶标记物浓度的选择
在免疫酶技术中,首先要确定的变异因素就是酶标记物的工作浓度。因为酶标记物浓度的很小变化,便可导致试验结果产生很大的波动。另外,由于浓度过高,可使非特异性反应增加,而浓度过低又可影响测定的敏感性。因此,正式实验前必须准确滴定其工作浓度。
羊驼抗体生产公司酶标记抗体的滴定方法是:将抗原(或抗体)物理吸附于固相载体上,然后将经过一系列稀释的酶标抗体(或Ig抗体)与吸附在载体上的抗原(或抗体)起反应,以酶与底物的显色反应程度来确定酶标记抗体的效价,或称工作浓度。
其步骤为:先将抗原(或抗体)用0.05M PH9.6包被缓冲液稀释为10μg/ml左右,于聚苯乙烯板孔内加0.1ml,4℃过夜,次日以洗涤缓冲液洗涤3次。酶标记抗体用1%BSA-PBS液依次稀释成1∶100,1∶200,1∶400,1∶800,1∶1600……(根据抗体的滴度而定),分别加入反应孔中,每个稀释度二孔,每孔0.1ml,37℃孵育1小时后洗涤。然后加底物液,每孔0.1ml,37℃10~30分钟。以2M H2SO4 0.05ml终止反应。
结果判定主要以ELISA比色仪读取各孔OD值。并以OD为纵座标,结合物浓度为横座标,绘制滴定曲线。由曲线上查得OD值为1.0左右,且曲线斜率最大时的酶标抗体稀释度,即为该标记物的工作浓度。
最后要说明的是,本法为ELISA直接法,所测的工作浓度与在实际应用中的最适浓度可相差几个滴度。这就要求在建立ELISA实验系统的过程中,以此基础上还应进一步确定实际工作浓度(可采用方阵法),以达到最适的实验条件。
以上就是酶标记浓度的相关知识,希望对大家的科研工作有所帮助。
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